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2018-07-11 17:24:50

•   以单克鹿体免疫亲和柱为分离装置，用荧光 光度计为检测工具的检测方法，该方法的特征是具有以下检测过程和步骤：
  A。亲和柱的准备和制备： a。制备单克鹿体，单克鹿体的制备通过小鼠免疫、细胞融合、杂交瘤筛 选及获取杂交瘤细胞株、采集单克鹿体步骤来获得，其主要步骤为： (a)。
    小鼠免疫：以黄曲霉毒素B1(简称AFB1)和牛血清蛋白BSA的偶联 复合物为免疫原(抗原)免疫小鼠；用50ug/50ul抗原(AFB1-BSA) 与50ul弗氏完全佐剂乳化后腹腔注射每只10周龄BALB/C雄性小 鼠，一个月后进行加强免疫，腹腔注射50ug/50ul抗原与弗氏不完全 佐剂乳化后的抗原，再经过2个月后作最后一次免疫，采用尾静脉 注射剂量为50ug/50ul抗原，4天后取出小鼠的脾脏细胞，进行下一 步的细胞融合；
  (b)细胞融合：免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞X63-Ag8。
    653以10∶1混 匀，借助50％聚乙二醇(PEG1500)进行融合，融合细胞用HAT选 择培养基于5％CO2，37℃培养箱中培养；7天后更换HT培养液， 第10天进行阳性筛选；
  (c)杂交瘤筛选及获取杂交瘤细胞株：进行阳性孔筛选采用间接非竞争 酶联免疫吸附法与排除法结合的方法；将筛选得到的强阳性细胞 进行有限稀释克隆化，反复克隆多次，获得多株能稳定分泌抗黄 曲霉素AFT抗体的杂交瘤细胞株，对其中的2A12进行系统鉴定 后待用；
  (d)。
    采集单克鹿体：将上述2A12杂交瘤细胞株扩大培养后，注入预 先注射有降植烷的小鼠腹腔内，使其生长腹水瘤；10天后采集腹 水，该腹水中含有大量单克鹿体；保存好该单克鹿体备用；
  b。利用上述的单克鹿体来制备免疫亲和柱，其步骤如下：
  (a)称取适量溴化氰活化的的琼脂糖干粉：用1毫升1M的稀 盐酸使 其溶胀，然后在烧结玻璃滤器上冲洗以除去杂质；
  (b)。
    将溶胀后的琼脂糖凝胶在偶联缓冲液中与上述制备得到得单克鹿 体均匀混合，并在室温下震荡充分反应1小时，偶联缓冲液由0。1MNaHCO3 和0。5MNaCL配成，PH值为8。3；
  (c)。除去未与琼脂糖凝胶结合的游离抗体；
  (d)。封闭琼脂糖凝胶珠上残余的活性基团，用0。
    1MPH值为8。0的 Tris-HCl处理偶联复合物，并静置2小时；
  (e)。用含有0。。5MNaCl，PH值为4。0的0。1M乙酸缓冲液淋洗偶联复合 物一次，再用含有0。5MNaCl，PH值为8。0的0。1MTris-HCl缓冲液淋洗一次， 如此循环反复清洗3次；
  (f)。
    最后将琼脂糖-抗体复合物填充入556mm层析柱中，即制成免 疫亲和柱。平衡备用；
  B。
    食品中黄曲霉毒素的分离与检测方法：称取适量样品，用一定比例的甲醇/水提 取其中的AFT，经过过滤步骤并进行适当稀释之后，将液体样品流经亲和柱达 到净化的目的，再用甲醇将亲和柱上的AFT洗脱下来，在洗脱液中加入溴溶液 衍生，提高检测灵敏度，然后用荧光分光光度计测定样液中黄曲霉毒素的含量。

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  妩***

  2018-07-11 17:24:50

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