利用药用真菌的子实体或菌核内部菌肉组织，在适宜条件下能生长出菌丝的特性，来分离获得纯菌种的方法。此法操作简便，取材方便，在野外采种或室内分离纯菌种时都可采用。组织分离是一种无性繁殖，菌丝细胞是双核细胞，双核菌丝中的两个核还未进行核配，也即双亲染色体并没有发生重组，所分离获得的菌种是该药用真菌的营养世代，容易产生变异，在适宜营养和培养条件下，选择典型的菌落进行培养，菌株则可保持其原菌种的优良品质，否则，其性状往往会发生变异。
  
(1)分离材料的选择与消毒在野外采集野生菌时，应根据采集的目的要求选择优良个体进行分离。分离人工栽培品种时，则应从优良品系中选择优良单株作种菇。对单菇的要求应该是优良性状典型、朵大、盖厚、无病虫危害，最好是用未成熟的菌蕾作分离材料。
虽然子实体和菌核的任何部位在适合其生长的培养基和培养条件下都可萌生菌丝，但不同的药用真菌，其子实体、菌核、菌索不同部位的组织，细胞分裂、生长的旺盛程度不完全一致，因此，在选取优良单株的分离部位时，也应有所区别。
  
组织分离时先应将分离材料用清水冲洗干净，去掉泥沙或污物，用纱布擦干水，即可移到无菌室进行分离前的消毒处理。一般较坚硬木质化的子实体或尚未突破菌幕的菌蕾及菌核，可在0。1% 的升汞液中浸泡1~3分钟，或用75%的酒精表面擦拭消毒；而较柔嫩的子实体，只能用75%的酒精棉球擦拭表面；一些胶质菌类的子实体，采用无菌水反复冲洗后即可分离。
  
(2)分离方法
①  子实体组织分离法：将要分离的子实体放入无菌室内，用无菌水冲洗数次，进行表面消毒，随即用消毒过的解剖刀从菇柄中部纵切一刀，撕开，挑取菌盖和菇柄交界处的一小块组织，移接到PDA斜面培养基上，加上棉塞，在适温下培养，可见组织块上长出绒毛状菌丝，对个体细小的伞菌子实体，也可采用子实层作组织分离材；对胶质菌类的组织分离，因子实体组织层较薄，质地较韧，菌丝数量极少，分离难度较大，一般分离时剖取尚未展开的耳片胶质团内部的组织块。
  
②  菌核组织分离法：有些真菌的子实体不易采集，而它们的营养贮藏器官菌核则较易获得，如猪苓、茯苓等。可采用菌核进行组织分离。
用菌核进行组织分离时，先将菌核冲洗干净，用纱布擦干水，移到接种室内，用75%酒精进行表面消毒，用无菌解剖刀把菌核切开，在接近菌核外壳附近，取黄豆粒大小的组织块，接入PDA 斜面试管培养基上，在25°C下培养。
  
③  菌索组织分离法：蜜环菌、亮菌、安络小皮伞等一类真菌可用菌索分离。分离时，在无菌条件下，用75%酒精进行表面消毒，可切取幼嫩的白色生长点，或用无菌解剖刀去掉黑色菌鞘，用无菌剪刀剪取一小段白色菌髓，将其接人试管PDA培养基上，于25°C下培养，即可得到该菌的菌种。