是荧光素（luciferin）在催化下发生的一连串复杂生化反应；而光即是这个过程中所释放的能量。由于不同种类的萤火虫，发光的型式不同，因此在种类之间自然形成隔离。萤火虫中绝大多数的种类是雄虫有发光器，而雌虫无发光器或发光器较不发达。虽然我们印象中的萤火虫大多是雄虫有两节发光器、雌虫一节发光器，但这种情况仅出现于熠萤亚科中的熠萤属（Luciola）及脉翅萤属（Curtos）萤火虫的发光器是由发光细胞、反射层细胞、神经与表皮等所组成。如果将发光器的构造比喻成汽车的车灯，发光细胞就有如车灯的灯泡，而反射层细胞就有如车灯的灯罩，会将发光细胞所发出的光集中反射出去。所以虽然只是小小的光芒，在黑暗中却让人觉得相当明亮
夜晚人们可以看到萤火虫一闪一闪地飞行，这是由于萤火虫体内一种称作虫萤光素酶的化学物质与氧气相互作用，从而产生的光亮。这种被称作虫萤光素酶的化学物质像开关一样启动这种反应，当萤火虫产生虫萤光素酶的时候，这种反应就开始了，萤火虫便会发出一闪一闪的光亮。
萤火虫的发光，简单来说，是荧光素（luciferin）在催化下发生的一连串复杂生化反应；而光即是这个过程中所释放的能量。由于不同种类的萤火虫，发光的型式不同，因此在种类之间自然形成隔离。萤火虫中绝大多数的种类是雄虫有发光器，而雌虫无发光器或发光器较不发达。
虽然我们印象中的萤火虫大多是雄虫有两节发光器、雌虫一节发光器，但这种情况仅出现于熠萤亚科中的熠萤属（Luciola）及脉翅萤属（Curtos）。因为像台湾窗萤（Pyrocoelia analis），雌雄都有两节发光器，两者最大的区别在于雌虫为短翅型，而雄虫则为长翅型。
萤火虫的发光器是由发光细胞、反射层细胞、神经与表皮等所组成。如果将发光器的构造比喻成汽车的车灯，发光细胞就有如车灯的灯泡，而反射层细胞就有如车灯的灯罩，会将发光细胞所发出的光集中反射出去。所以虽然只是小小的光芒，在黑暗中却让人觉得相当明亮。
而萤火虫的发光器会发光，起始于传至发光细胞的神经冲动，使得原本处于抑制状态的荧光素被解除抑制。而萤火虫的发光细胞内有一种含磷的化学物质，称为荧光素，在荧光素的催化下氧化，伴随产生的能量便以光的形式释出。由于反应所产生的大部分能量都用来发光，只有2~10%的能量转为热能，所以当萤火虫停在我们的手上时，我们不会被萤火虫的光给烫到，所以有些人称萤火虫发出来的光为“冷光”。
至于萤火虫发光的目的，早期学者提出的假设有求偶、沟通、照明、警示、展示及调节族群等功能；但是除了求偶、沟通之外，其它功能只是科学家观察的结果，或只是臆测。直到近几年，才有学者验证了警示说：1999年，学者奈特等人发现，误食萤火虫成虫的蜥蜴会死亡，证实成虫的发光除了找寻配偶之外，还有警告其它生物的作用；学者安德伍德等人在1997年以老鼠做的试验，证实幼虫的发光对于老鼠具警示作用。
萤火虫于夜晚的发光行为，以黑翅萤（Luciola cerata）为例，就目前的研究发现，多是在日落后，雄虫开始在栖地上边飞边亮；在雄虫开始活动不久后，雌虫便开始出现于栖地周围的高处（雌虫也会发光，但只有发光器一节，雄虫则有两节发光器），从晚上7点一直到11点半左右，在其栖地可以见到成百成千的萤火虫发光，但差不多在晚上11点半过后，成虫便逐渐停止发光。
而且雄虫发光的频率也有变化，并非整晚的发光频率都一样。 能够发光的生物还有海洋中的藻类和萤科的其它昆虫，它们都是利用虫萤光素酶与氧气产生反应，从而发出光亮的。 。
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