关于PCR克隆基因的引物问题
想拿到一个基因的CD区，CD区一共1400bp，用引物A（上游引物）,B（下游引物）扩出了1-1200bp前面一段，引物C（上游引物）,D（下游引物）扩出了1000-1400bp后面一段，可是用A和D做引物PCR什么条带都没有，甚至连引物二聚体都没有...用primer5分析这对引物虽然得分不高，但也还算可以，毕竟这两个引物和别的引物一对的话还是能扩出来的...请大家帮忙分析一下原因，是否还有必要继续摸索条件用这对引物继续扩完整CD区...跪谢...TT
你看，你分别获得了1-1200 nt以及1000-1400 nt这两段序列，那么中间有200 bp长度的序列是重叠的，对吧？也就是说你已经从序列信息上获得了这个CD区所有的序列信息。如果你只是需要序列信息的话，已经足够了，但是如果你需要扩增得到这完整的1400 bp用于后续的实验，那么你需要继续扩增完整的CD区。
如果这样的话，我有个小窍门，你可以把1-1200 nt以及1000-1400 nt这两个片段混合和作为模板，然后利用引物A和D进行扩增，很容易就能得到完整的1400 bp产物，不过前提是你第一步变性退火的时候，时间适当的长一些，让这两个大片段能够混合退火，即让两个片段重叠的200 bp部分能够退火，便于你扩增。
