通常在接种箱内进行。将选好的种菇、试管培养基、接种工具、无菌水、75%酒精棉球等一起放人接种箱内，然后对接 种箱进行严格消毒。具体方法是：按接种箱体积每立方米空间 用福尔马林10毫升、高锰酸钾5克。先将高锰酸钾倒人烧杯、  陶瓷等容器中，然后注人福尔马林，迅速密闭好接种箱，熏蒸 30-40分钟。
  也可用气雾消毒剂2克在接种箱中点燃（因气雾  剂最小包装为2克/包），密闭熏蒸30 -40分钟。若接种箱内 比较清洁，可不用上述熏蒸法，只需用紫外线灯照射20-30 分钟即可。紫外线灯照射时，人员不可在其旁边，以防眼角 膜、视网膜受伤。关闭紫外灯后，不要马上开启日光灯；若在  白天，紫外灯关闭后，最好用黑布将接种箱罩严，遮光30分 钟左右，以免因光复活作用，而使细菌等杂菌部分复活，降低 灭菌效果。
  接种箱消毒后，先用75%酒精棉球消毒双手和接种  工具，然后，用无菌水将种菇冲洗数次，用无菌纱布或滤纸吸 干水分后（若菇体没有尘土等污染物，就不必洗），再用75% 酒精棉球对种菇表面消毒1 - 2次。菇体外表消毒处理的时间 要短，只要药物均勻接触整个菇体后即可中止，以免菇体产生 药害。
  将手术刀在酒精灯上灼烧，并在酒精灯旁冷却后，将种 菇从菌柄处开始向上一分为二纵切两半，或用消毒过的手指将  种菇纵向掰开，在细胞分裂最旺盛、再生能力最强的菌盖与菌 柄连接处，用接种钩（或小镊子）钩取（或镊取）断面内部1 块3-5毫米X2-3毫米大小（如绿豆粒）的菇体组织，迅速 移植到斜面培养基的中部或略偏内处，并塞好棉塞。
  每个断面 钩取（或慑取）5-10块后，应将种菇再切开一个新断面继续 钩取（或镊取），以减少杂菌污染的几率。全部试管接种完毕，  即可移出接种箱，进行恒温、遮光培养。通常在24 -2度下培养6-10天，菌丝就可长满斜面。其菌丝洁白，气生菌丝旺 盛，绵毛状，培养基不变色，培养后期菌丝层边缘带褐色。
  一 般是当菌丝长至1-2厘米长时，或菌丝在培养基上长满后， 就可选取菌丝生长健壮、优良、无杂菌污染的试管，进行转管 扩大（又叫提纯），即可获得原始母种。所得的原始母种，还 需进一步选优去劣，或通过出菇试验后，才能用于生产。另需提及的是，不宜长期使用组织分离法来培养母种。
  因 为长期采用无性繁殖，易导致菌株生活力衰退。应采用孢子分  离（有性繁殖）与组织分离（无性繁殖）交替进行的方法来 培养。一般每次生产出菇后，都应挑选符合本品种特征的优良 子实体进行组织分离，每1-2年进行一次孢子分离。将孢子 分离所得的菌种，经出菇鉴定后，选性状优良者再进行组织分  离。
  这样，以孢子分离来发现好的变异菌株，用组织分离来巩 固这些优良菌株的遗传特性，才能产生出更优良的母种。