4。1。1 DNA的连接策略质粒 具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆 较小的DNA片段(<10kb)且结构简单，质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆，从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段，然后体外使两者相连接，再用所得到重组质粒转化细菌，即可完成。
外源DNA片段和质粒载体 的连接反应策略有以下几种：(1)互补性粘性末端的连接单一限制性内切酶 或两种限制性内切酶 (为同尾酶，如BamHI和BglII)分别处理载体和外源DNA，得到的粘性末端为互补性突出末端，在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子 串连形成寡聚物，且正反两种连接方向都可能有。
为了降低载体的自身环化，使正确的连接产物数量达到最高水平，一般载体DNA和外源DNA的分子 数比(浓度比)为1：3～1：10之间。同时，为了最大限度地抑制质粒DNA的自身环化，还可将载体DNA的5’磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉，防止其自身环化。
而带5’端磷酸的外源DNA片段可有效地与去磷酸化的载体相连，产生一个带有两个缺口的开环分子，在转入E。coli 受体菌后该种缺口可在DNA复制 过程种自动修复。(2)非互补粘性末端的连接用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端，这DNA重组 中最容易克隆的DNA片段。
一般情况下，常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。也可在PCR 扩增时，在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。
该种粘性末端的连接载体DNA和外源DNA的分子数比(浓度比)通常为为1：1。(3)平头末端的连接是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA聚合酶 补平所致。由于平端的连接效率比粘性末端要低得多，故在其连接反应中，T4 DNA连接 酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要高得多。
通常还需加入低浓度的聚乙二醇(PEG 8000)以促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。特殊情况下，外源DNA分子的末端与所用的载体末端无法相互匹配，则可以在线状质粒载体末端或外源DNA片段末端接上合适的接头(linker)或衔接头(adapter)使其匹配，也可以有控制的使。
平末端质粒载体和平末端外源DNA体外连接的方法有(+)4。1。1 DNA的连接策略质粒 具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆 较小的DNA片段(<10kb)且结构简单，质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆，从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段，然后体外使两者相连接，再用所得到重组质粒转化细菌，即可完成。
外源DNA片段和质粒载体 的连接反应策略有以下几种：(1)互补性粘性末端的连接单一限制性内切酶 或两种限制性内切酶 (为同尾酶，如BamHI和BglII)分别处理载体和外源DNA，得到的粘性末端为互补性突出末端，在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子 串连形成寡聚物，且正反两种连接方向都可能有。
为了降低载体的自身环化，使正确的连接产物数量达到最高水平，一般载体DNA和外源DNA的分子 数比(浓度比)为1：3～1：10之间。同时，为了最大限度地抑制质粒DNA的自身环化，还可将载体DNA的5’磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉，防止其自身环化。
而带5’端磷酸的外源DNA片段可有效地与去磷酸化的载体相连，产生一个带有两个缺口的开环分子，在转入E。coli 受体菌后该种缺口可在DNA复制 过程种自动修复。(2)非互补粘性末端的连接用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端，这DNA重组 中最容易克隆的DNA片段。
一般情况下，常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。也可在PCR 扩增时，在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。
该种粘性末端的连接载体DNA和外源DNA的分子数比(浓度比)通常为为1：1。(3)平头末端的连接是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA聚合酶 补平所致。由于平端的连接效率比粘性末端要低得多，故在其连接反应中，T4 DNA连接 酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要高得多。
通常还需加入低浓度的聚乙二醇(PEG 8000)以促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。特殊情况下，外源DNA分子的末端与所用的载体末端无法相互匹配，则可以在线状质粒载体末端或外源DNA片段末端接上合适的接头(linker)或衔接头(adapter)使其匹配，也可以有控制的使。
DNA限制酶作用于磷酸二酯键DNA连接酶作用于磷酸二酯键DNA聚合酶作用于磷酸二酯键DNA解旋酶作用于氢键DNA连接酶连接手段编辑目前已知有三种方法可以用来在体外连接DNA片段：第一种方法是，用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片段；第二种方法是，用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA片段连接起来，或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片段加上poly（dA）poly（dT）尾巴之后，再用DNA连接酶将它们连接起来；第三种方法是，先在DNA片段末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成粘性末端之后，再用DNA连接酶将它们连接起来
答：质粒载体pBR322是研究得最多，使用最早且应用最广泛的大肠杆菌炙粒载体之一。符号质粒载体pBR322中的“p代表质粒；“BR”代表两位两位研究者Bolivar...详情>>
答：看哪个专业了。毕竟是名校，所以生物教学质量也不错。举例说，微生物学山东大学、复旦、武大见长，细胞生物北大、山大、兰大见长。 相对来说，生物是它的软肋，但正在改善...详情>>
答：考研的科目是不同的,看你选择什么学校, 每个学校对考研的科目要求是不同的, 但细胞生物学,是生物化学,,你应该是要学好的, 因为面试的时候,,问题应该都有涉及这...详情>>
答：魔力教育理论详情>>
