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MediaselectionAligandalreadycoupledtoamatrixisthesimplestsolution.SelectingprepackedcolumnssuchasHiTraporHiPrepwillnotonlybemoreconvenient,butwillalsosavetimeinmethodoptimizationasthesecolumnsaresuppliedwithdetailedinstructionsforoptimumperformance.Ifaligandisavailable,butneedstobecoupledtoapre-activatedmatrix,refertoChapter5.Ifnosuitableligandisavailable,decidewhetheritisworththetimeandeffortinvolvedtoobtainaligandandtodevelopaspecificaffinitymedium.Inmanycases,itmaybemoreconvenienttousealternativepurificationtechniquessuchasionexchangeorhydrophobicinteractionchromatography.PreparationofmediaandbuffersStoragesolutionsandpreservativesshouldbewashedawaythoroughlybeforeusinganyaffinitymedium.Re-swellaffinitymediasuppliedasfreeze-driedpowdersinthecorrectbufferasrecommendedbythemanufacturer.Usehighqualitywaterandchemicals.Solutionsshouldbefilteredthrough0.45μmor0.22μmfilters.Reuseofaffinitymediadependsonthenatureofthesampleandshouldonlybeperformedwithidenticalsamplestopreventcross-contamination.Ifanaffinitymediumistobeusedroutinely,caremustbetakentoensurethatanycontaminantsfromthecrudesamplecanberemovedbyproceduresthatdonotdamagetheligand.Bindingandelutionbuffersarespecificforeachaffinitymediumsinceitistheirinfluenceontheinteractionbetweenthetargetmoleculeandtheligandthatfacilitatestheaffinitybasedseparation.Someaffinitymediamayalsorequireaspecificbufferinordertomakethemediumreadyforuseagain.17Avoidusingmagneticstirrersastheymaydamagethematrix.Usemildrotationorend-over-endstirring.SamplepreparationandapplicationSamplesshouldbeclearandfreefromparticulatematter.Simplestepstoclarifyasamplebeforebeginningpurificationwillavoidcloggingthecolumn,mayreducetheneedforstringentwashingproceduresandcanextendthelifeofthechromatographicmedium.Appendix1containsanoverviewofsamplepreparationtechniques.Ifpossible,testtheaffinityof :performabufferexchangeusingadesaltingcolumnordiluteinbindingbuffer(seepage134).Samplepreparationtechniquesshouldensurethatcomponentsknowntointerferewithbinding(theinteractionbetweenthetargetmoleculeandtheligand)areremoved.Sinceaffinitychromatographyisabindingtechnique,thesamplevolumedoesnotaffecttheseparationaslongasconditionsarechosentoensurethatthetargetproteinbindsstronglytotheligand.Itmaybenecessarytotestforaflowratethatgivesthemostefficientbindingduringsampleapplicationsincethisparametercanvaryaccordingtothespecificinteractionbetweenthetargetproteinandtheligandandtheirconcentrations.Thecolumnmustbepre-equilibratedinbindingbufferbeforebeginningsampleapplication.
媒介选择 一ligand已经连接到一个矩阵是最简单的解决。 选择预先包装列 诸如HiTrap或者HiPrep将不仅仅更方便，但是也将在中节省时间 方法优化当这些列被提供最佳的详尽的指令时 性能。 如果一ligand是可供使用的，但是需要被连接到一个前激活的矩阵，参阅第5章。
如果没有适合的ligand不可供使用，决定它是否是值得的时间和努力包括到 获得一ligand和开发一种具体的密切关系媒介。 在许多情况下，它可能是更多 方便使用诸如离子交换或者hydrophobic的预备的净化技术 相互作用色层分离法。
准备媒介和缓冲器 存储解决方案和防腐剂应该在使用任何之前彻底地加以洗刷 密切关系媒介。 再膨胀密切关系媒介作为中的冻结弄干了粉提供正确 作为由制造厂的缓冲器。 使用高的质量水和化学品。 解决方案应该通过0。45μm被过滤或者 0。
22μm过滤器。 对密切关系媒介的再利用依赖于抽样的性质并且仅仅应该被执行 有防止横跨污染的相同的抽样。 如果一种密切关系媒介通常被使用，关心必须被拿保证任何 从粗糙的抽样的污染物能被不破坏的过程移去 ligand。 自从它是他们的影响，捆绑和洗提缓冲器对每一密切关系媒介是具体的 在有利于affinitybased的目标分子和ligand之间的相互作用时 分开。
一些密切关系媒介也可能要求一个具体的缓冲器为了做 为对于使用作好准备的媒介再一次。 17 当他们可能破坏矩阵时，使用磁性的搅动者避免。 使用温和的旋转或者 结束微型结束激动人心。 抽样准备和应用 抽样应该是清楚的和没有颗粒状的问题。
简单的步骤澄清一种抽样 在开始净化之前将避免阻塞列，可能减少对的需要 严格的洗涤过程并且能扩展chromatographic媒介的生活。 附录1包含抽样准备技术的一种综述。 如果可能的话，测试ligand的密切关系： 目标分子相互作用。
太低密切关系意志 在贫穷的产量中的结果自从目标蛋白质可能通过洗涤或者从列渗漏 在抽样应用期间。 太高密切关系将自从目标分子以来导致低的产量 可能不在洗提期间从ligand分离。 目标蛋白质的捆绑可能被调整抽样使更有效到 捆绑的缓冲器的作品和pH： 使用除去执行一个缓冲器交换 列或者在捆绑的缓冲器(参见第134页)中稀释。
抽样准备技术应该保证为所知道的组成部分干扰 捆绑(目标分子和ligand )之间的相互作用被移去。 由于密切关系色层分离法是一种捆绑的技术，抽样卷不影响 只要条件被选择保证目标蛋白质固定分开 强烈ligand。 它是可能必要为了在期间给最有效的捆绑的一种流率测试 自从这参数以来抽样应用能根据具体的相互作用变化 在目标蛋白质和ligand和他们集中之间。
列必须在开端抽样应用之前在捆绑的缓冲器中被平衡。 。
媒介选择 ligand 已经被结合对矩阵是最简单的解答。选择被预先包装的专栏 譬如HiTrap 或HiPrep 不仅将是方便, 但并且将节省时间 方法优化作为这些专栏被提供以详细的指示为最宜 表现。 如果ligand 是可利用的, 但需要被结合对一个前被激活的矩阵, 参见章节5 。
如果适当的ligand 不是可利用的, 决定是否它值得时间和努力被介入 获得一ligand 和开发一个具体亲合力媒介。在许多情况下, 它也许是更多 方便使用供选择的洗净技术譬如离子交换或疏水 互作用色谱法。 媒介和缓冲的准备 存贮解答和防腐剂应该周到地以前冲走使用任何 亲合力媒介。
Re 胀大亲合力媒介被供应作为被冰冻干燥的粉末在正确 缓冲依照由制造商推荐。 使用高质量水和化学制品。解答应该被过滤通过0。45?m 或 0。22?m 过滤器。 亲合力媒介再用取决于样品的本质, 应该只执行 以相同样品防止cross-contamination 。
如果亲合力媒介将定期地被使用, 必须被保重保证那任何 污染物从粗暴样品可能被不损坏的规程去除 ligand 。 束缚和elution 缓冲是具体的为各个亲合力媒介因为这是他们的影响 在互作用在目标分子和促进的ligand 之间affinitybased 分离。
一些亲合力媒介也许并且要求具体缓冲为了做 媒介准备好待用再。 17 避免使用磁性绞拌器如同他们也许损坏矩阵。使用温和的自转或 结束在结束搅动。 样品准备和应用 样品应该是确切和释放从粒状物质。简单的步澄清样品 在开始洗净将避免堵塞专栏, 也许减少需要为之前 严密洗涤物规程, 可能延长色谱分析的媒介的生活。
附录1 包含样品准备技术概要。 如果可能, 测试ligand 的亲合力: 瞄准分子互作用。太低亲合力将 导致粗劣的出产量因为目标蛋白质也许洗涤通过或泄漏从专栏 在试样应用期间。太高亲合力导致低出产量从目标分子 不可以离解从ligand 在elution 期间。
束缚目标蛋白质也许由调整使更加高效率样品对 约束缓冲的构成和酸碱度: 进行缓冲交换使用脱盐 专栏或稀释在约束缓冲(参见页134) 。 样品准备技术应该保证组分知道干涉与 束缚(互作用在目标分子和ligand 之间) 被取消。 因为亲合力色谱法是一个约束技术, 样品容量不影响 分离只要情况被选择保证目标蛋白质束缚 强烈对ligand 。
它也许是必要测试对于在期间给最高效率的捆绑的流速 试样应用因为这个参量可能变化根据具体互作用 在目标蛋白质和ligand 和他们的集中之间。 专栏必须是pre-equilibrated 在约束缓冲在起点试样应用之前。 。
答：楼主的单词拼写有一些错误，做了稍许更改，翻译如下 One hundred years ago, school teachers were expected to...详情>>
答：There is not a moment to be lost. 一刻也没有错过 There are many people rushing into the...详情>>
