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引物设计引物设计原则编辑1、长度:1530bp,其有效长度[Ln2(G十C)十(A十T)]一般不大于38,否则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度(74度),从而降低产物的特异性
1个回答
若不能避开这一区域时,用7deaza2′脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的
尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C,否则会使引物在G十C富集序列区错误引发
④两个引物之间不应存在互补序列,尤其是避免3 ′端的互补重叠。
引物的3’端的∆G值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应
引物设计要求编辑做RealTime时,用于SYBRGreenI法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的
●PCR扩增产物长度:引物的产物大小不要太大,一般在80250bp之间都可;80~150bp最为合适(可以延长至300bp)
设计引物过程中,可以Lock每个参数,如Tm值范围和引物3’端的稳定性等;●以多种形式存储结果;支持多用户,每个用户可保存自己的特殊设置
引物长度小于20时,其Tm恒等于4×(G十C)十2×(A十T)
引物设计有3条基本原则:首先引物与模板的序列要紧密互补,其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构,再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)
7、3’末端:如果可能的话,每个引物的3‘末端碱基应为G或C
引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话,应尽量使其△G值不要过高(应小于4.5kcal/mol,∆G值是指DNA双链形成所需的自由能,该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性),否则易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行
GC含量引物序列的GC含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应
引物自身:不能含有自身互补序列,否则会形成发夹样二级结构
引物引物设计编辑引物是人工合成的两段寡核苷酸序列,一个引物与目的基因一端的一条DNA模板链互补,另一个引物与目的基因另一端的另一条DNA模板链互补
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