慢性游走性红斑是早期的特征性表现，具有诊断意义，但20～40％患者不出现此种红斑。BB在患者组织内和血液内的数量很少，不易找到。BB的分离培养也较为困难。目前，血清抗BB抗体IgM和IgG的测定是诊断本病最灵敏和特异的检查方法，常用测定方法有间接免疫荧光法和酶联免疫吸附试验。血清IgM抗体的高峰多出现在患病后3～6周时,而IgG抗体升高较慢，高峰通常在数月以后。两种抗体的阳性率分别为67～90％和90～100％。
应与下列疾病相鉴别。
1、风湿病：该病有发热、环形红斑、关节炎及心脏受累等，可依据血清溶血性链球菌抗体，包括抗链球菌溶血素“O”、抗链激酶、抗透明质酸酶及抗M蛋白抗体等增高，C反应蛋白阳性及病原学检查等有助鉴别。
2、类风湿关节炎：该病为慢性自身免疫性疾病，有对称性多关节炎，从小关节开始，以后累及大关节。血清中类风湿因子及抗类风湿协同抗原抗体(抗RANA抗体)阳性，关节腔穿刺液找到类风湿细胞及X线检查等，一般可以鉴别。
3、鼠咬热：该病由小螺菌及念珠状链杆菌所致，有发热、皮疹、游走性关节痛、心肌炎及中枢神经系统症状等易与莱姆病混淆。可根据典型的ECM、血清学及病原学检查等进行鉴别。
4、恙虫病：恙螨幼虫叮咬处之皮肤焦痂和溃疡的特点，斑丘疹和淋巴结肿大与EM不同，血清外-斐反应(OXk)及间接免疫荧光测定特异抗体有助诊断。
5、梅毒：两者均有皮肤、心脏、神经和关节病变，以及由于疏螺旋体属和梅毒密螺旋体属之间有共同抗原性，梅毒患者亦可出现抗莱姆病螺旋体的交叉反应性抗体。然而，梅毒血甭试验阴性结果有助于莱姆病和梅毒的区别。
其他尚需与病毒性脑炎、神经炎及真菌感染的皮肤病相鉴别。
