散发性结直肠癌错配修复基因hMLH1的研究进展如何了？

1、错配修复基因hMLH1的发现错配修复基因是纠正碱基错配的主要因子，它不同于其它抑制基因对细胞的无序增长具有直接的作用，而是通过修复DNA复制过程中产生的错误，维持基因组的稳定性，避免突变，间接抑制肿瘤的发生。目前已发现人类的MMR系统含有9个错配修复基因，其中以hMLH1和hMSH2功能最为重要，hMSH2和hMLH1基因突变占所有检测到突变的90%以上。hMLH1是继Fishel等在1993...

1、错配修复基因hMLH1的发现错配修复基因是纠正碱基错配的主要因子，它不同于其它抑制基因对细胞的无序增长具有直接的作用，而是通过修复DNA复制过程中产生的错误，维持基因组的稳定性，避免突变，间接抑制肿瘤的发生。目前已发现人类的MMR系统含有9个错配修复基因，其中以hMLH1和hMSH2功能最为重要，hMSH2和hMLH1基因突变占所有检测到突变的90%以上。hMLH1是继Fishel等在1993年在HNPCC细胞中首先分离出与大肠杆菌mutS同源的hMSH2之后的MMR家族中的又一个错配基因的发现。该基因定位于3p21，是细菌错配修复基因mutl的同源物，与大约30％的HNPCC有关，hMLH1的cDNA全长2484hp，编码长度为2268bp的开读框架，hMLH1蛋白由756个氨基酸残基组成，与酵母错配修复基因hMLH1比较有41％的同源性，hMLH1在结直肠癌中可能起着一种看家基因的作用。在部分HNPCC患者中hMLH1基因在第4l位密码子有一个C—T突变，使相应的氨基酸残基由丝氨酸变成苯丙氨酸。另外，在HNPCC的患者中还检测到了第578至632位密码子之间的杂合性缺失及从第727位密码子的第一个核苷酸开始的4个核苷酸的缺失，在另外一些病例的第519位密码子则存在一个T的插入，造成hMLH1蛋白产物的羧基端238个氨基酸残基的缺失。另外，张晓梅等在结直肠癌患者的体细胞中发现了位于hMLH1基因第ll5l位碱基T—A的杂合型颠换，导致其第384位编码氨基酸由缬氨酸(Va1)突变为天冬氨酸(Asp)，随后的研究结果表明，Va1384Asp作为东亚人hMLH1基因上的一个多态位点。

2、错配修复基因的功能和作用机制hMLH1和其它的MMR基因的基本功能一样，是消除DNA复制过程中由于DNA聚合酶滑移而引起碱基-碱基错配和插入-缺失突环的形成。碱基-碱基错配损害主要影响非重复的DNA，从而导致单碱基的错配，表现为DNA复制错误(replicationerrors,RER)，而插入-缺失环的形成会影响DNA重复序列，引起短重复序列的插入或缺失，亦可表现为微卫星的插入或缺失，从而表现为微卫星不稳定(microsatelliteinstablility,MSI)性。DNA复制过程中，在复制一个重复单位后，子链与模板链分离，然后与下一个或下几个重复单位重新结合，使一个或几个重复单位形成“环凸”区域。正常情况下该结构可被MMR系统所校正，但MMR系统失常时，子链DNA如继续延伸即可引起突变。目前MMR基因的作用机制仍不很清楚，推测可能是人类MMR基因编码的错配修复蛋白可相互作用形成一种多聚复合物，参与细胞错配修复反应。hMLH1和hPMS2蛋白形成hMutLα二聚体，与结合到DNA链上的hMutS形成一种暂时性的复合物，从而启动错配修复，在DNA聚合酶Ⅲ、DNA连接酶、单链结合蛋白、外切核酸酶及增殖细胞核抗原等的参与下，切除含有错配碱基的一段DNA链，然后重新合成一段DNA链，这样就修复了含错配碱基的DNA核苷酸链。结直肠杆菌细胞中的这种修复机制是通过错配修复系统识别碱基正确的母链和错配的子链来进行修复反应的，即利用两条链的甲基化状态的不同来进行区别的。一般DNA复制后，子链会在甲基化酶的作用下被甲基化，但在子链合成后的很短时间内，其不会被甲基化，这样错配修复系统能区分甲基化的母链和非甲基化的子链，这种修复机制被认为是甲基导向错配修复机制(methyldirectedmismatchrepair)，人类错配修复系统也需这种作用。

3、MMR基因hMLH1的检测人们使用各种不同的方法对包括散发性结直肠癌在内的癌症病人的hMLH1基因改变及其引起的相关改变进行检测，目前常用的方法如下：正常或肿瘤组织的微卫星序列通过PCR扩增，聚丙烯凝胶电泳分离或者通过荧光PCR自动生成以检测肿瘤组织的微卫星不稳定性；通过异源双链分析检测hMLH1功能；hMLH1突变的直接检测包括，基于DNA的检测技术如PCR、SSCP、DGGE，基因组DNA测序；基于RNA的检测技术如RT-PCR、cDNA测序等方法。另外较常用的体外耦联的转录翻译反应技术(IVTT)；通过甲基化特异性PCR，检测hMLH1基因甲基化状态，这些方法各有其优缺点，微卫星不稳定性可以间接反映错配修复系统是否失活，较为简单、可靠，但只能间接反应错配修复系统的总体情况，而不能直接反映错配修复系统是如何失活的，而且MSI与其它多种因素都有关系，单单MSI不能肯定说明MMR系统的改变；异源双链分析用于检测基因功能，因此只能检测基因的功能，而不能反映基因到底是如何发生变化的；SSCP或DGGE可以检测MMR基因突变情况，但每次反应只能检出检测基因的个别外显子；IVTT法用于检测移码突变，hMLH1基因有40％为移码突变，该方法可以快捷、有效、可靠地检出基因突变造成的截短型蛋白质，但无法检测其他的突变，如错义突变、部分移码突变等不造成蛋白质截短的MMR基因突变；检测MMR基因甲基化状态可以反映MMR基因甲基化情况，对于肿瘤非遗传机制的研究可以提供一个依据，但甲基化状态的研究反映的只是MMR基因发生改变的可能的一小部分机制而已。因此，在对MMR基因进行研究时，我们有必要时以上技术进行筛选，选其中的几个方法进行实验，使它们能取长不短。
1993年Ionow和Aaltonen等发现，在几乎所有的HNPCC肿瘤和约12%~15%的散发性CRC中存在着微卫星上的突变，称作微卫星不稳定性(microsatelliteinstability,MSI)，由此提出了另一条崭新的途径——错配修复途径。它的基本原理是MMR基因保证了DNA复制的高度保真，一旦MMR基因发生突变或启动子甲基化引起错配修复基因失活，导致机体错配修复功能的降低，进而导致整个基因组的不稳定，MMR功能缺陷的表现型是高度的微卫星不稳定(MSIH)，又称之为复制错误(repliationerror,RER)阳性，从而使某些癌基因和抑癌基因的突变在体内得到快速聚集，肿瘤由此发生，表现为肿瘤细胞的DNA多为二倍体或近二倍体的含量，在此途径中，hMLH1和hMSH2这两个MMR基因起主要作用。RER阳性的散发性CRC与RER阴性者相比，具有不同的临床病理、分子生物学特征，表现为：发病年龄较轻；多位于近端结肠，且易伴发肠内或肠外其他器官的多发性肿瘤；对某些化疗药物(如5-FU、顺铂等)有原发性耐药；肿瘤细胞DNA多为二倍体或近二倍体；低分化腺癌、黏液腺癌及印戒细胞癌多见，但较少发生淋巴结转移，生物学行为较好。近年研究发现，hMLH1蛋白的表达变化结果可以很好地预示MMR功能缺陷的存在。

DNA错配修复基因(DNAmismatchrepairgene)首先在细菌和酵母中发现，在人类基因组中也存在类似物。这种基因的突变在人类遗传性非息肉型结直肠癌(hereditarynonpolyposiscolorectalcancer,HNPCC)和散发性结直肠癌（sporadicColorectalCancer,SCRC）的发病过程中起重要作用。DNA错配修复基因既非癌基因，也非抑癌基因，是另一类肿瘤相关基因，这是继癌基因与抑癌基因之后，在肿瘤发病的分子机制方面的又一重大进展。错配修复基因（MMR）是一类和人类的错配修复反应有关的基因，包括hMSH2、hMLH1、hMSH3、hMSH6、hPMSH1和hPMSH2等基因。其中，又以hMSH2为尤为重要。